二、?對(duì)片段進(jìn)行注釋

1.給編碼序列命名：

點(diǎn)擊其中一個(gè)箭頭，按Feature→Add?Translated?Feature，彈出以下窗口：

Feature：給該片段命名。

Type：選擇該片段的類型，右側(cè)箭頭代表閱讀方向。

Color：選擇顏色。

2.?給非編碼序列命名：如多克隆位點(diǎn)。先找到質(zhì)粒圖譜中的多克隆位點(diǎn)的第一個(gè)酶切位點(diǎn)和最后一個(gè)酶切位點(diǎn)。點(diǎn)擊左側(cè)sequence，找到兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的序列。

3.?給質(zhì)粒圖譜增加引物序列：按Edit→Find，輸入引物序列，找到質(zhì)粒序列對(duì)應(yīng)位置，點(diǎn)擊Primers→Addprimer，彈出該界面：

按上下游引物選擇TopStrand還是BottomStrand，在Primer處可給該引物命名，隨后即可顯示該引物在圖譜Map中的位置。

三、?創(chuàng)建新DNA文件?

1.?打開SnapGene，點(diǎn)擊New?DNA?File，彈出以下窗口：

在Create?the?following?sequence窗口下輸入DNA序列，并對(duì)該文件命名，點(diǎn)擊OK?；蚴屈c(diǎn)擊Import?from?Genebank，輸入NCBI中某序列的access?number，點(diǎn)擊OK。

2．此時(shí)彈出如下窗口：

3.對(duì)該序列進(jìn)行注釋：點(diǎn)擊Features→Add?Feature，對(duì)該序列進(jìn)行命名注釋。

△創(chuàng)建質(zhì)粒圖譜文件方法相同。

四、處理序列翻譯信息

1.創(chuàng)建一個(gè)DNA序列文件，點(diǎn)擊

2.顯示如下箭頭：

黃色箭頭代表的是上面一條鏈編碼序列，綠色箭頭代表的是下面一條鏈編碼序列。

3.點(diǎn)擊Sequence，點(diǎn)擊右側(cè)箭頭，選擇All?6?Frames，可得到編碼序列的所有情況，其中代表的是終止密碼子。

4.添加內(nèi)含子：根據(jù)內(nèi)含子的位置，點(diǎn)擊Edit→Select?Range，輸入內(nèi)含子堿基位置。點(diǎn)擊Features→Delete?Feature?Segment，得到如下圖：

紫色粗帶為外顯子，虛線為內(nèi)含子部分。

五、引物、PCR和突變繪制

1.PCR引物繪制：在多克隆位點(diǎn)處找到合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)。如BamHI和XbaI，在目的基因兩側(cè)截取15-30bp序列，點(diǎn)擊Primers→Addprimers，選擇top?strand或bottom?strand，如圖：

給該引物命名，然后點(diǎn)擊Insertion，在該引物上添加之前選擇好的酶切位點(diǎn)序列，如圖選擇了BamHI，點(diǎn)解Insert：

然后在該序列5端上添加數(shù)個(gè)堿基作為保護(hù)堿基。點(diǎn)擊完成。

△下游引物設(shè)計(jì)相同，不再贅述。

2.突變引物繪制：在目的基因上截取一小段包含要突變位點(diǎn)的序列，點(diǎn)擊Primers→Add?primers，為該引物命名，在5’序列突變位點(diǎn)的三個(gè)堿基畫黑，如圖：

點(diǎn)擊Insertions，選擇突變成的氨基酸，點(diǎn)擊Insert。即可獲得該突變引物，點(diǎn)擊Reverse?Complement，可獲得反向引物。

六、模擬標(biāo)準(zhǔn)限制性克隆

1.打開被插入片段的質(zhì)粒圖譜，選擇合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)，如HindIII和ApaI，如圖：

點(diǎn)擊Actions→Insert?Fragment，點(diǎn)擊HindIII+鍵盤Shift鍵+Apa，點(diǎn)擊Insert，在source?of?fragment處選擇插入的目的片段來源。點(diǎn)擊上述同樣的酶，給該重組質(zhì)粒命名，點(diǎn)擊clone。

七、?模擬融合克隆

1.?打開一個(gè)需要插入片段質(zhì)粒圖譜，點(diǎn)擊Actions→Insert?One?Fragments，彈出以下窗口：

2.?點(diǎn)擊sequence，找到想要發(fā)生替換的位點(diǎn)。

3.?點(diǎn)擊Fragment，在Source?of?Fragment處選擇替換片段的另外一個(gè)質(zhì)粒圖譜。此時(shí)彈出另外一個(gè)質(zhì)粒圖譜圖樣。

4.?點(diǎn)擊用于替換的片段，觀察該片段閱讀方向與被替換質(zhì)粒位點(diǎn)的方向是否一致，如不一致，點(diǎn)擊更換方向。

5.?選擇后，點(diǎn)擊Product，點(diǎn)擊Choose?Overlapping?PCR?Primers，此時(shí)即形成融合后的質(zhì)粒圖譜。

6.若想獲得引物的序列，點(diǎn)擊Primers→Export?Selected?Primers，選擇保存。

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